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    本發明之目的係在藉由毛囊原基的移植使毛髮再生的技術中，控制再生毛色。本發明提供一種移植後生長的生毛毛色經控制之移植用再生毛囊原基的製造方法，其包括下述步驟：調製含有間葉系細胞的第1細胞集合體之步驟；調製含有上皮系細胞的第2細胞集合體之步驟；調製含有色素幹細胞的細胞集合體之步驟；前述第1細胞集合體和前述第2細胞集合體之至少其中一者，與前述含有色素幹細胞的細胞集合體結合之步驟；以及，接下來使前述第1細胞集合體和前述第2細胞集合體至少其中一者與前述含有色素幹細胞的細胞集合體結合之前述第1細胞集合體與前述第2細胞集合體密接，並於支撐體內部培養之步驟。
    公开号:TW201309800A
    申请号:TW101106174
    申请日:2012-02-24
    公开日:2013-03-01
    发明作者:Koh-ei TOYOSHIMA；Takashi Tsuji
    申请人:Organ Technologies Inc；
    IPC主号:C12N5-00
    专利说明:
    毛色經控制之移植用再生毛囊原基的製造方法、含有該移植用再生毛囊原基的組成物及其移植方法
    本案發明係關於一種毛色經控制之移植用再生毛囊原基的製造方法、含有該移植用再生毛囊原基的組成物及其移植方法。
    作為補足移植醫療之次世代的醫療技術，期待各種疾病或外傷導致功能不全的臟器或器官置換成再生的臟器或器官之再生醫療(非專利文獻1)。至今的再生醫療研究中，於受到傷害的組織或有部分功能障礙的器官中移入幹細胞或前驅細胞，使功能回復之幹細胞移入療法有所進展。
    從單一細胞種所構成之二維組織的再生、皮膚或角膜上皮細胞、心肌細胞等中，藉由細胞片技術將細胞培養成片狀而組織化的組織再生技術接近實用化之階段。其中，皮膚組織係將間葉系細胞之纖維母細胞與皮膚表皮細胞多層化，人為地再現組織學上適切的層結構而可再生功能性皮膚，臨床應用於嚴重燒傷的治療中。
    另一方面，已知器官係將複數種功能的細胞以三維配置而顯示特有功能。幾乎所有器官係藉由胎兒期的上皮系細胞與間葉系細胞之交互作用而產生，發揮特有形態或器官功能。以現在的再生醫療技術，難以將複數種細胞配置成三維，尚未開發在生物體外即時有功能的再生器官架構。
    到最近，將外胚層器官之齒或唾液腺、皮膚附屬器官之毛囊中使器官原基再生，藉由再現發生過程使再生器官作為目標之研究有所進展。已知該等器官雖然並非與維持生命直接相關，但會陷入器官喪失或功能不全。就其例子，可例舉如因齲齒或傷害、齒胚形成不全導致牙齒的喪失、伴隨高齡化之唾液分泌障礙、因男性型脫毛症或毛囊形成不全導致毛髮的喪失等。如此之器官喪失或功能不全對於生活品質(Quality of Life)造成很大的影響，因此大為期待藉由器官再生而回復功能。
    一般而言，哺乳類或鳥類中，毛、羽毛及爪等外胚層皮膚附屬器遍佈於皮膚，具有生存或生殖等生物種獨特的功能。哺乳類中的毛具有保持體溫或者對外傷及紫外線的防禦功能。再者，認為靈長類等高等哺乳類，藉由毛髮而於體表產生有特徵的顏色或花樣，在生殖集團內之順位或展現生殖能力有作用。又，毛髮因應其於體表的區域或功能而在粗細、硬度、顏色等毛的性質上產生差異，於特定部位大量存在而發揮其審美上及功能上的價值。認為尤其是人類，頭髮的顏色和品質有社會上的意義，因年齡增長或疾病所導致之變化對於個人的生活品質造成很大的影響。
    足以臨床應用的毛囊再生醫療之確立上，需要：再生毛囊有正常組織結構，於移植部位有適當的毛幹之毛形成、伸長。此種含有毛等皮膚附屬器之外胚層附屬器官通常係藉由於胎兒期時上皮/間葉系細胞的相互作用而產生。已知外胚層附屬器官之一的毛囊經個體的生涯而重複成長與退化(毛周期)，成長期之毛球部的再生係藉由與毛囊器官發生期同樣的分子機構而誘導。又，認為如此之毛周期之毛球部的再生係藉由間葉系細胞之毛乳突細胞而誘導。亦即，成長期中，毛囊上皮幹細胞係藉由間葉系細胞之毛乳突細胞而分化誘導使毛球部再生。再者，認為隆起(bulge)區域及其下方區域存在有源自神經脊之幹細胞的棲位(niche)，因此毛囊保持複數個幹細胞棲位，作用為幹細胞池(pool)。
    至今為止毛囊再生，嘗試藉由置換間葉系細胞(毛乳突細胞及真皮毛根鞘細胞)而使毛囊可變區域再生，或由具有毛囊誘導能力之間葉系細胞而使毛囊新生、由上皮/間葉系細胞而再構築毛囊等。再者，最近本發明者等藉由器官原基法(例如參考專利文獻1)，從源自成體小鼠鬍鬚的隆起區域上皮細胞與源自成體小鼠鬍鬚的培養毛乳突細胞所再構築之再生毛囊原基模擬正常產生，顯示可再生毛囊與毛。然而，使用源自成體小鼠鬍鬚的再生毛囊原基以使毛囊再生時，有再生的毛幾乎成為白色毛之問題。 [先前技術文獻] [專利文獻]
    [專利文獻1]國際公開第2006/129672號冊子 [非專利文獻]
    [非專利文獻1]Sharpe PT,Young CS.Test-tube teeth.Sc.Am.293,34-41,2005
    如同上述，至今尚未報告有足以臨床應用之毛囊再生技術，尤其是針對毛色控制之毛囊再生技術。尤其是將毛髮的再生技術適用於人類時，必需得到藉由源自成體的組織之毛色經控制之再生毛，強烈期望有控制源自成體組織的再生毛的毛色之方法。
    為了解決上述課題，本發明者等首先著眼於掌管毛色的細胞之黑色素原細胞(melanoblast)的分布與其分布區域，解析於各自的分布區域存在的細胞之功能。然後，本發明者等藉由應用該黑色素原細胞分布區域所含細胞的功能，而發現毛色經控制之移植用再生毛囊原基之製作方法。
    亦即，本發明係關於一種移植後生長的生毛毛色經控制之移植用再生毛囊原基的製造方法，該移植用再生毛囊原基之製造方法包括下述步驟：調製含有間葉系細胞的第1細胞集合體之步驟；調製含有上皮系細胞的第2細胞集合體之步驟；調製含有色素幹細胞的細胞集合體之步驟；前述第1細胞集合體和前述第2細胞集合體之至少其中一者與前述含有色素幹細胞的細胞集合體結合之步驟；以及，接下來，使前述第1細胞集合體和前述第2細胞集合體至少其中一者與前述含有色素幹細胞的細胞集合體結合之前述第1細胞集合體與前述第2細胞集合體密接，並於支撐體內部培養之步驟。
    在此，本發明之移植用再生毛囊原基之製造方法的一實施態樣中，前述第1細胞集合體係實質上由間葉系細胞所構成。
    又，本發明之移植用再生毛囊原基之製造方法的一實施態樣中，前述第2細胞集合體係實質上由上皮系細胞所構成。
    又，本發明之移植用再生毛囊原基之製造方法的一實施態樣中，前述含有色素幹細胞的細胞集合體係經過單一化處理者。
    又，本發明之移植用再生毛囊原基之製造方法的一實施態樣中，前述色素幹細胞係源自副隆起(sub bulge)區域的黑色素原細胞或源自毛基質(hair matrix)底部的黑色素細胞前驅細胞。
    又，本發明之移植用再生毛囊原基之製造方法的一實施態樣中，使前述細胞集合體彼此結合之步驟中，前述第1細胞集合體的細胞數或前述第2細胞集合體的細胞數，與前述含有色素幹細胞的細胞集合體的細胞數之比在0.1：1至100：1的範圍內。
    又，本發明之移植用再生毛囊原基之製造方法的一實施態樣中，前述間葉系細胞係毛乳突細胞或真皮毛根鞘細胞。
    又，本發明之移植用再生毛囊原基之製造方法的一實施態樣中，前述上皮系細胞係隆起區域上皮細胞或毛基質底部上皮細胞。
    又，本發明之移植用再生毛囊原基之製造方法的一實施態樣中，前述間葉系細胞或上皮系細胞係源自成體的毛囊。
    又，本發明之移植用再生毛囊原基之製造方法的一實施態樣中，復包含於前述再生毛囊原基中插入導引件(guide)之步驟。
    又，本發明之移植用再生毛囊原基之製造方法的一實施態樣中，移植前述再生毛囊原基時再生的再生毛囊具備黑色素原細胞的幹細胞棲位。
    又，本發明之移植用再生毛囊原基之製造方法的一實施態樣中，移植前述再生毛囊原基時再生的再生毛囊可永續地形成有色毛。
    本發明之其他態樣係關於一種藉由上述移植用再生毛囊原基之製造方法而製作的含有毛色經控制之移植用再生毛囊原基之組成物。
    再者，本發明之其他態樣係關於一種毛色經控制之移植用再生毛囊原基的移植方法，其包括將藉由上述移植用再生毛囊原基之製造方法而製作的移植用再生毛囊原基移植到對象部位之步驟。
    又，本發明之移植用再生毛囊原基之移植方法的一實施態樣中，藉由使前述導引件維持在比移植部位更突出的狀態，而使移植的再生毛囊原基的上皮系細胞側的一部分與前述對象之上皮系細胞沿著導引件延伸、連結。
    若依據本發明，則可藉由使用製作再生毛囊原基時與上皮系細胞或間葉系細胞不同之另外調製的色素幹細胞，製作移植後最初生毛的毛為有色毛之移植用再生毛囊原基。又，依據本發明所製作的移植用再生毛囊原基，可再生不僅有毛色並且具有正常毛幹之毛。
    再者，本發明之一實施態樣中，依據本發明所製作的移植用再生毛囊原基之移植後再生的再生毛囊中，可形成黑色素原細胞的幹細胞棲位。藉此，毛囊中的黑色素原細胞之幹細胞棲位可在維持黑色素原細胞的同時並適宜地供給黑色素細胞，因此經長期間仍可形成有色毛。
    本發明之製造方法的第一態樣係移植後生長的生毛毛色經控制之移植用再生毛囊原基的製造方法，包括下述步驟：調製含有間葉系細胞的第1細胞集合體之步驟；調製含有上皮系細胞的第2細胞集合體之步驟；調製含有色素幹細胞的細胞集合體之步驟；前述第1細胞集合體和前述第2細胞集合體之至少其中一者與前述含有色素幹細胞的細胞集合體結合之步驟；以及，接下來，使前述第1細胞集合體和前述第2細胞集合體其中一者與前述含有色素幹細胞的細胞集合體結合之前述第1細胞集合體與前述第2細胞集合體密接，並於支撐體內部培養之步驟。
    本說明書中「間葉系細胞」係指源自間葉組織的細胞及培養此等細胞所得的細胞，「上皮系細胞」係指源自上皮組織的細胞及培養此等細胞所得的細胞。
    色素細胞係指分布於皮膚的表皮層與真皮層內以及毛囊的上皮層內，並製作出黑色素的細胞，色素細胞所製作的黑色素與毛髮的顏色有很深的關係。又，已知色素細胞係由色素幹細胞或色素細胞之前驅細胞而分化。
    又，本說明書中，「色素幹細胞」係指分化成色素細胞(黑色素細胞)之黑色素細胞前驅細胞、黑色素原細胞(色素幹細胞)。再者，含有色素幹細胞時，可使用上述細胞中之任一種，亦可組合使用。又，黑色素原細胞係指可分化成黑色素細胞及黑色素細胞前驅細胞，未分化狀態之不具有色素的幹細胞。黑色素原細胞係於毛囊中的特定的幹細胞棲位，維持長期間、未分化之狀態。又，黑色素細胞前驅細胞係指可分化成黑色素細胞的前驅細胞，未分化狀態之不具有色素的前驅細胞。然後，色素細胞(黑色素細胞)係指最終分化之具有色素的細胞。
    又，本說明書中，「含有色素幹細胞的細胞集合體」係指包括含有上述色素幹細胞的組織或區域，該等組織或區域經過酵素處理或單一化處理等分離成細胞單位之狀態的細胞，或將分離的細胞經過離心分離等成為細胞凝集塊之狀態。又，含有色素幹細胞的細胞集合體，可為實質上由色素幹細胞構成的細胞集合體。
    又，本發明中，「隆起區域」係指比毛囊的皮脂腺附著部位更下方，且比豎毛肌(arrector pili muscle)附著部位更上方的毛囊恆定區域。再者，不存在豎毛肌的小鼠臉頰鬍鬚等情況下，在相當於豎毛肌附著部位的部位存在有香腸環(Ringwurst)。Ringwurst係指附著於臉頰鬍鬚毛囊不變部的更下端部的源自神經脊之間葉細胞構成的環狀結構，係齧齒類的臉頰鬍鬚特有的結構。因此，本說明書中，不存在豎毛肌之臉頰鬍鬚等的毛囊之「隆起區域」係指比毛囊的皮脂腺附著部位更下方，且比Ringwurst更上方的區域。再者，恆定區域(不變部區域)係指沒有與毛囊的毛周期相關之成長或退化等毛囊的組織結構上之變化的區域。「副隆起區域」係指鄰接於隆起區域下方之恆定區域的最下端部。
    又，本發明中，「毛基質底部」係指位於毛球部的毛基質中比歐氏(Auber)線更下方，未分布產生黑色素的黑色素細胞之區域。
    本說明書中，「再生毛囊原基」係指藉由包含下述步驟之方法而製作的毛囊原基，含有間葉系細胞的第1細胞集合體與含有上皮系細胞的第2細胞集合體密接，並於支撐體內部培養之步驟。
    「含有間葉系細胞的第1細胞集合體與含有上皮系細胞的第2細胞集合體密接，並於支撐體內部培養之步驟」例如專利文獻1、日本特開2008-29756號公報、日本特開2008-206500號公報、日本特開2008-200033號公報及日本特開2008-29757號公報所記載，該等各文獻揭示之整體作為參考而組入本說明書中。
    上述第1細胞集合體和第2細胞集合體之至少其中一者與含有色素幹細胞的細胞集合體結合。其後，與另一細胞集合體一起於支撐體內部培養，製作再生毛囊原基。此時，上述第1細胞集合體與第2細胞集合體任一者可與含有色素幹細胞的細胞集合體結合，又，亦可兩者與含有色素幹細胞的細胞集合體結合。
    再者，黑色素原細胞存在於毛囊的上皮層，因此使用黑色素原細胞作為色素幹細胞時，結合至含有上皮系細胞的細胞集合體者可維持幹細胞功能而較佳。
    再者，本說明書中，「第1或第2細胞集合體與含有色素幹細胞的細胞集合體結合」係指包含使某細胞集合體以整體或一部分的方式與其他細胞集合體混合，又包含使細胞集合體的表面彼此接觸或接著。因此，與含有色素幹細胞的細胞集合體結合的第1或第2細胞集合體為於該細胞集合體中混合有色素幹細胞之狀態、或含有色素幹細胞狀態。
    第1細胞集合體和第2細胞集合體之至少其中一者與含有色素幹細胞的細胞集合體結合之步驟中，第1細胞集合體的細胞數或第2細胞集合體的細胞數與含有色素幹細胞的細胞集合體的細胞數之比可依使用的細胞等條件而適宜設定，例如較佳係調整成0.1：1至100：1的範圍內，更佳係調整成0.1：1至10：1的範圍內，再更佳係調整成0.5：1至2：1的範圍內。
    然而，第1細胞集合體的細胞數或第2細胞集合體的細胞數與含有色素幹細胞的細胞集合體的細胞數之比，只要可控制製作的再生毛囊原基的毛色，並不限定於上述範圍。
    第1細胞集合體及第2細胞集合體兩者與含有色素幹細胞的細胞集合體結合時，相對於各個細胞集合體，可以使其成為上述範圍內的方式與含有色素幹細胞的細胞集合體結合。
    又，此時藉由調整與第1細胞集合體或第2細胞集合體結合的色素幹細胞的細胞數之比例，可控制毛色的濃淡。
    又，使含有色素幹細胞的細胞集合體結合後，使第1細胞集合體與第2細胞集合體密接，並於支撐體內部培養之步驟中，含有間葉系細胞的細胞集合體的細胞數與含有上皮系細胞的細胞集合體的細胞數之比可依使用的細胞等條件而適宜設定，例如較佳係調整成0.1：1至3：1的範圍內，更佳係調整成0.3：1至1：1的範圍內。再者，培養時若提高上皮系細胞的細胞數之比率，則可期望再生毛的產生率提昇與毛質提昇，就此觀點而言較佳。
    又，上述第1細胞集合體與第2細胞集合體，任一細胞集合體中含有色素幹細胞時，另一細胞集合體可實質上僅以間葉系細胞或實質上僅以上皮系細胞構成。「實質上僅以間葉系細胞構成」係指本發明中，某細胞集合體與僅由間葉系細胞構成時達到相同功能。較佳係盡可能不含成為間葉系細胞之細胞以外者的狀態。又，若為間葉系細胞，則可含有不同種類的細胞。「實質上僅以上皮系細胞構成」之情況亦相同。
    在此，細胞集合體係指細胞為密接狀態或細胞為不密接之狀態皆可，可為組織或從組織採取後經過單一化處理的細胞群，亦可為從分散的細胞調製的細胞凝集塊。若使用組織，則有容易得到細胞配置或形狀正確的器官之優點，但有可取得的量有限制之情況。細胞凝集塊亦可用培養細胞，因此比較容易取得，至少就這一點而言較佳。再者，為了製作再生毛囊原基而將細胞集合體注入支撐體內部，使其密接培養時，細胞集合體較佳係細胞為密接的狀態之組織或細胞凝集塊。
    若使用源自毛囊的色素幹細胞作為本發明所使用的色素幹細胞，則容易決定朝向毛囊再生的方向，就這一點而言較佳。例如使用黑色素原細胞作為色素幹細胞時，可使用存在於毛囊的副隆起區域之黑色素原細胞，又，使用黑色素細胞前驅細胞作為色素幹細胞時，可使用存在於毛囊的毛基質底部之黑色素細胞前驅細胞。
    又，就源自毛囊以外的色素幹細胞，可使用分布於皮膚內的表皮層內者。
    本發明所使用之間葉系細胞與上皮系細胞之至少一者較佳係源自毛囊(包含構成毛囊之器官、組織、細胞)。藉此，使用已決定朝向毛囊的方向之細胞，可輕易地形成器官。又，為了更確實地製造毛囊，最佳係間葉系細胞與上皮系細胞皆源自毛囊。
    亦即，製作再生毛囊原基時，可使用源自毛囊之間葉系細胞或上皮系細胞。更具體而言，可使用毛乳突細胞、真皮毛根鞘細胞及發生期的皮膚間葉系細胞等作為間葉系細胞，可使用隆起區域的外毛根鞘最外層細胞及毛基質底部的上皮系細胞等作為上皮系細胞。又，可使用由iPS細胞、ES細胞誘導之毛囊間葉系細胞作為間葉系細胞，可使用由iPS細胞、ES細胞誘導之毛囊上皮系細胞作為上皮系細胞。
    又，用來採取間葉系細胞、上皮系細胞及色素幹細胞的毛囊較佳係成長期者。使用源自成長期的毛囊的細胞，而可高頻率地誘導品質良好的再生毛。又，毛囊可源自胎兒或源自成體。從源自胎兒的毛囊採取細胞時，可有效率地採取毛囊器官發生期的毛囊細胞，又，因可取得未分化的細胞，故就這點而言較佳。另一方面，從源自成體的毛囊採取細胞時，利用器官內之細胞分布的區域性而可分離取得有用的細胞，故就這點而言較佳，尤其是將本發明應用於人類臨床時，可利用對象者的細胞，因此就避免免疫導致之排斥反應、避免利用ES細胞等倫理問題之觀點而言較佳。再者，有移植後的毛囊經免疫耐受(immunological tolerance)之報告(Reynolds et.al.,Trans-gender induction of hair follicles.Nature.1999 Nov 4；402(6757)：33-4.)、或者若可藉由其他方法而進行免疫抑制，則可利用美容形成手術等而產生的別家的源自成體的手術材料等，產業利用上的價值非常高而較佳。
    可使用源自生物體內其他間葉系組織的細胞作為源自毛囊以外的間葉系細胞。較佳係不包含血液細胞之骨髓細胞、間葉系細胞，更佳係口腔內間葉系細胞、顎骨內部的骨髓細胞、源自頭部神經脊細胞的間葉系細胞、可分化成該等間葉系細胞之間葉系前驅細胞或其幹細胞等。作為間葉系細胞，使用源自羊膜的細胞之例記載於日本特開2008-206500號公報，使用全能性幹細胞經過分化誘導之細胞之例記載於日本特開2008-200033號公報，該等揭示之整體作為參考而組入本說明書中。
    作為源自毛囊以外的上皮系細胞，可使用源自生物體內其他上皮系組織的細胞。較佳係皮膚或口腔內黏膜或牙齦的上皮系細胞，更佳係可分化成皮膚或黏膜等已分化，例如角質化或角質化不全的上皮系細胞之未成熟的上皮系前驅細胞，例如非角質化上皮系細胞或其幹細胞等。使用口腔內上皮細胞或其初代培養細胞作為上皮系細胞之例如日本特開2008-29756號公報所記載，該揭示之整體作為參考而組入本說明書中。再者，從自體組織的利用之觀點來看，較佳係使用移植對象的間葉系細胞及上皮系細胞或者含有該等細胞的組織。
    用來製作再生毛囊原基的間葉系細胞、上皮系細胞、色素幹細胞、或者含有該等細胞的組織可採取自哺乳動物之靈長類(例如人類、猴子等)、有蹄類(例如豬、牛、馬等),小型哺乳類之囓齒類(例如小鼠、大鼠、兔子等)之外，尚有狗、貓等各種動物。間葉系細胞、上皮系細胞、色素幹細胞、或者含有該等細胞的組織之採取通常只要直接使用可用於組織採取之條件即可，以無菌狀態取出並保存於適當的保存液中即可。
    源自毛囊之間葉系細胞及上皮系細胞的調製，例如首先將從周圍組織分離的毛囊依照形狀，分離成間葉組織及上皮組織而進行。
    又，源自毛囊之色素幹細胞的調製，例如將含有黑色素原細胞的副隆起區域分離時，在顯微鏡檢查下，以皮脂腺與豎毛肌作為記號，可分離作為鄰接隆起區域之恆定部最下端部。又，分離含有黑色素細胞前驅細胞的毛基質底部時，在顯微鏡檢查下，以毛乳突的毛球部作為記號，可從比Auher氏線更下方的可變部最下端部分離。再者，於黑色素原細胞的標記(maker)之Dct的啟動子(promoter)下導入編排有GFP之基因之源自動物的細胞或培養細胞作為材料時，可從經由酵素處理而單一化的細胞，進一步用細胞分類器(cellsorter)分離/取得黑色素原細胞。又，從組織將間葉系細胞、上皮系細胞、副隆起區域及毛基質底部等分離時，可使用使分離容易進行之酵素。就酵素而言，可例舉如中性蛋白酶(dispase)、膠原酶(collagenase)、胰蛋白酶(trypsin)等公知者，該領域者可使用適宜較佳的酵素。
    又，從毛囊分離的間葉系細胞、上皮系細胞、或含有色素幹細胞的細胞集合體在使用於再生毛囊原基的製作前，較佳係通過細胞分離用過濾器，進行單一化處理。單一化處理係指使細胞間的接著解離而具有流動性，藉由該處理，可使添加細胞均勻混合，又，製作再生毛囊原基時可用微量滴管(micropipette)操作而較佳。細胞分離用過濾器只要可將間葉系細胞、上皮系細胞、或含有色素幹細胞的細胞集合體從其他組織及其他細胞分離者即無特別限定。細胞分離用過濾器的孔徑依採取的細胞而異，可由該領域者適宜地選擇，例如可使用具有40μm至100μm的孔徑的過濾器。
    本發明之細胞凝集塊意指源自間葉組織或上皮組織的細胞凝集者、含有色素幹細胞的細胞群凝集者、或者源自間葉組織或上皮組織的細胞與含有色素幹細胞的細胞群凝集者等。如此之細胞凝集塊，例如可使將間葉組織、上皮組織、或含有色素幹細胞的區域凌亂地分散而得到之細胞，或者使該細胞的初代或繼代培養而得到之細胞凝集並調製。
    為了使細胞分散，可使用中性蛋白酶、膠原酶、胰蛋白酶等酵素。為了得到充分的細胞數，調製細胞凝集塊前進行分散的細胞的初代或繼代培養時，就培養所用的培養基而言，一般用於動物細胞培養的培養基，例如可使用達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium；DMEM)等。作為添加用以促進細胞增殖的血清或者代替血清者，例如可添加FGF、EGF、PDGF等細胞增殖因子或運鐵蛋白(transferrin)等已知血清成分。再者，添加血清時的濃度可依照當時的培養狀態而適宜地變更，通常可為10%左右。細胞培養通常的培養條件適用例如於約37℃的溫度、5% CO2濃度的培養箱內培養。又，可為適宜添加鏈黴素等抗生素者。
    為了使細胞凝集，例如將細胞懸浮液進行離心處理即可。間葉系細胞及上皮系細胞的細胞凝集塊，較佳係兩者密接時使其分別為高密度狀態以確實進行細胞交互作用。高密度狀態係指與構成組織時的密度同等程度，例如5×107個/ml至1×109個/ml，較佳係1×108個/ml至1×109個/ml，最佳係2×108個/ml至8×108個/ml。使細胞凝集塊為高密度之方法無特別限定，例如可藉由將細胞經過離心處理而凝集並沉澱化之方法而進行。離心處理可簡便地高密度化且不損細胞活性而較佳。離心處理係進行以賦予300×g至1200×g，較佳係500×g至1000×g的離心力之回轉數進行3分鐘至10分鐘即可。低於300×g的離心處理，有無法使細胞密度充分變高之傾向，另一方面，高於1200×g的離心處理，有細胞受到損傷之情況。
    藉由離心分離調製高密度細胞凝集塊時，通常在用於細胞的離心分離的試管等容器中調製細胞懸浮液後進行離心分離，留下作為沉澱物之細胞並盡可能去除上清液即可。此時，作為目的之細胞以外的成分(例如培養液、緩衝液等)較佳係與細胞的容量為等量以下，最佳係不含作為目的之細胞以外的成分。若使如此高密度的細胞集合體藉由後述方法而於支撐載體內密接，則細胞緊密地接觸，有效地發揮細胞間交互作用。
    又，含有間葉系細胞或上皮系細胞與色素幹細胞的細胞凝集塊的製作，例如可如上述方式藉由離心分離處理而調製，具體而言，離心分離時的細胞懸浮液中，分別以較佳比例調整包含含有間葉系細胞或上皮系細胞與色素幹細胞的細胞集合體，藉由離心分離處理，可製作混入色素幹細胞的細胞凝集塊。
    就以培養第1及第2細胞集合體為目的使用的支撐載體而言，只要可於內部進行細胞培養者即無特別限定，例如較佳係凝膠狀、纖維狀、固體狀者，藉由使用該支撐載體，更可防止生物體內之再生毛囊原基受到過剩的壓力。
    本發明所用之支撐載體，可例舉如膠原蛋白、瓊脂糖凝膠、羧甲基纖維素、明膠、瓊脂、水膠、Cellmatrix(商品名)、Mebiolgel(商品名)、Matrigel(商品名)、彈性蛋白、血纖維蛋白、基膜素(laminin)、細胞外基質混合物、聚乙醇酸(polyglycolic acid；PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)等。其中，較佳係具有適宜的硬度和保持力之膠原蛋白、瓊脂糖凝膠、羧甲基纖維素、明膠、瓊脂、水膠、Cellmatrix、Mebiolgel、Matrigel、細胞外基質混合物、彈性蛋白、血纖維蛋白、基膜素。
    例如，支撐載體使用液狀者，可在配置由第1和第2細胞集合體所構成之再生毛囊原基後使其硬化。例如於培養用皿(dish)上製作膠原蛋白凝膠滴，於膠原蛋白滴內配置再生毛囊原基後，藉由於37℃之CO2培養箱內培養，可使膠原蛋白凝膠化。
    以培養第1及第2細胞集合體為目的所使用之支撐載體，較佳係具備細胞不分散並可保持細胞集合體的密接狀態之保持力。密接狀態係指上述高密度的間葉系細胞及上皮系細胞的細胞集合體在間葉系細胞與上皮系細胞的接觸面附近亦維持相同程度的高密度之狀態。可保持密接狀態之支撐載體，例如為膠原蛋白時，最終濃度2mg/ml至3mg/ml之濃度，亦即依據JIS-K6503-1996的方法(測定作為以12.7mm徑的柱塞(plunger)壓下4mm所需的荷重)提供適宜使用成為120g至250g的凝膠強度之濃度的硬度。其他種類的支撐載體亦以同樣的評估方法而有相同強度即可較佳使用作為本發明的支撐載體。又，藉由混合1種或複數種的支撐載體，可得作為目的之凝膠強度有相當硬度的支撐載體。
    將第1及第2細胞集合體配置於支撐載體內之方法無特別限定，細胞集合體為細胞凝集塊時，例如可將由上述的離心分離得到沉澱物用微注射器等插入支撐載體內而配置。細胞集合體為組織時，可使用注射器的針的前端等而配置於支撐載體內的任意位置。
    本發明中使第1與第2細胞集合體於支撐載體密接配置之方法無特別限定，例如其中一個細胞集合體配置於支撐載體內後，將另一個細胞集合體以擠壓另一者的方式配置，可使兩者密接。更具體而言，於支撐載體內適宜變更上述注射器的針的前端之位置，可使其中一個細胞集合體擠壓另一個細胞集合體。再者，作為細胞集合體使用上皮系組織或間葉系組織時，該組織在原本的器官(包含屬於該器官之組織)中，分別與間葉系組織或上皮系組織接觸的面，較佳係以與另一個細胞集合體接觸的方式配置。
    又，較佳係設置配置後使支撐載體固化之步驟。藉此，細胞進一步凝集，可作為更高密度的狀態。例如膠原蛋白凝膠的情況，於培養溫度下靜置數分鐘至數十分鐘而可固化。此時，細胞集合體內之細胞以外的成分越少越能實現高密度狀態。
    培養期間係依配置於支撐載體內部的細胞數、細胞集合體的狀態、培養條件、動物種等而異，該領域者可適宜地選擇。
    培養期間越長則可使再生毛囊原基的形成更加進行。為了得到期望的狀態，例如可培養1天以上、2天以上、6天以上、30天以上、50天以上、100天以上、或300天以上，可在培養途中變更培養基或培養條件。
    例如移植再生毛囊原基時，為了得到有功能的毛髮，較佳係再生毛囊原基至少培養1天，2天以上更佳。
    支撐載體內部之培養步驟，可單獨培養內含第1及第2細胞集合體的支撐載體，亦可在其他動物細胞等存在下培養。
    單獨培養支撐載體時，培養條件可為一般動物細胞的培養使用的條件。又，培養可添加源自哺乳動物的血清，又或者可添加對該等細胞的增殖或分化有效之已知的各種細胞因子。如此細胞因子，可例舉如FGF、BMP等。
    從細胞集合體的氣體交換和營養供給的觀點來看，以及從沒有與其他動物細胞的接觸/混入並且全步驟可以體外(in vitro)進行之觀點來看，較佳係支撐載體內部之培養為器官培養。器官培養係一般使多孔性膜漂浮(float)在適於動物細胞增殖的培養基上，於該膜上載置內含第1及第2細胞集合體的支撐載體並進行培養。在此使用的多孔性膜較佳係具有多數0.3至5μm左右的孔者，可例舉如Cellcultureinsert(商品名)、Isopore Filter(商品名)。
    又，依據本發明其他態樣，第1與第2細胞集合體於支撐載體密接配置，或在培養後，可將導引件插入第1與第2細胞集合體構成之再生毛囊原基。
    本發明可使用之「導引件」係指插入至由器官培養構築的培養中的再生毛囊原基，再生毛囊原基移植後，用以促進再生毛囊原基的上皮系細胞側的一部分與接受者(recipient)側的上皮系細胞之連結者。就可使用之導引件，只要具有上述效果者即無特別限制，可例舉如尼龍等聚合物、由合成或天然之生物體可吸收的聚合物製作的纖維、不銹鋼等金屬纖維、碳纖維、及玻璃纖維等化學纖維，以及天然的動物纖維、植物纖維等，更具體而言，可例舉如尼龍線、不銹鋼線等。尤其是對於再生毛囊原基，可將源自生物體的毛髮作為導引件使用。又，本發明所使用之導引件可為中空線的形狀。導引件的直徑可由該領域者適宜地設定，例如較佳係5至100μm，更佳係20至50μm。又，對再生毛囊原基使用的導引件長度亦可由該領域者適宜地設定，例如較佳係1至10mm，更佳係4至6mm。
    導引件的插入係以不會破壞再生毛囊原基的結構，尤其係以不會破壞第1細胞集合體與第2細胞集合體的接觸面而垂直貫穿第1細胞集合體與第2細胞集合體之方式，從成為再生毛囊原基之細胞集合體的上皮系細胞側插入。
    又，對成為再生毛囊原基的細胞集合體插入導引件，可在器官培養開始時立即，亦即在上皮系細胞及間葉系細胞配置於培養基內後立即插入。培養一陣子後，將導引件插入時，再生毛囊原基的上皮系細胞藉由器官培養而細胞接著的強度更為增加，因此使導引件的素材強度(例如使用不銹鋼線等)與導引件的前端銳利等以增加貫通力，可在培養開始後第1至2天插入。導引件插入的時間點為器官原基作成時立即插入時，可使用尼龍線等對生物體之異物反應低且撓性的素材之觀點而言較佳。又，培養一陣子後將導引件插入時，第1細胞集合體與第2細胞集合體的接觸面更為堅固地接著，不會因導引件的插入而破壞接觸面，就這點而言較佳。
    又，對再生毛囊原基插入導引件後，可在再生毛囊原基為導引件插入的狀態下培養。導引件插入後之培養期間，例如較佳係培養1至4天，更佳係培養1.5至2天。導引件插入後，藉由培養2天，導引件與再生毛囊原基之接著變強，移植時不易脫落。又，藉由導引件插入後的培養，使再生毛囊原基的上皮系細胞側的一部分可沿著導引件延伸而較佳。如此之延伸在再生毛囊原基移植後，可使再生毛囊原基的上皮系細胞側的一部分與接受者的上皮系細胞之自律接著效率及安定性提昇。
    本發明之一實施態樣中，由本發明的製造方法製作的移植用再生毛囊原基係於移植後再生的毛囊內，可形成功能性黑色素原細胞的幹細胞棲位之再生毛囊原基。該黑色素原細胞的幹細胞棲位係與天然毛囊相同，在副隆起區域的外毛根鞘形成。在此，功能性黑色素原細胞的幹細胞棲位係指構成該棲位的部分中，具有維持黑色素原細胞的功能的同時，並具有使黑色素細胞分化/供給之功能者。本發明之一實施態樣之移植用再生毛囊原基，可再生具備功能性黑色素原細胞的幹細胞棲位的毛囊，因此該毛囊可永續地形成有色毛。
    又，依據本發明之其他態樣，提供一種由本發明的製造方法製作的毛色經控制之移植用再生毛囊原基移植到對象部位之方法。
    藉由移植由本發明的製造方法製作的毛色經控制之移植用再生毛囊原基，可在移植部位得到毛色經控制之生毛。尤其是即使由源自成體的毛囊再構築再生毛囊原基時，藉由其再生毛囊原基的移植，可在移植部位得到有色毛。
    毛色經控制之移植用再生毛囊原基，可由該領域者以公知方法移植至對象部位，例如可使用Shapiro式植毛術、使用CHIO式植毛器之植毛、利用空氣壓之植入器(implanter)等而移植。Shapiro式植毛術係指於對象移植部位用微解剖刀(microscalpel)等製造移植創傷後，使用鑷子移植移植物之方法。應用如此植毛術時，移植用再生毛囊原基具有導引件，因此可不需直接接觸再生毛囊原基而操作，可簡便地操作。
    再生毛囊原基的移植深度，例如較佳係0.05至5mm，更佳係0.1至1mm，最佳係0.3至0.5mm。尤其是將再生毛囊原基移植到接受者時，較佳有移植到真皮層內之情形，更佳有移植到比起毛囊形成及其後的生毛效率優異的真皮/皮下組織的境界面更上方之情形。移植時的再生毛囊原基係將再生毛囊原基的上皮系細胞側於接受者的體表面側，再生毛囊原基的間葉系細胞側於接受者的體內側的方式移植，就可將生毛方向控制於體表面側這點而言較佳。又，於移植創上端部，再生毛囊原基的上皮系細胞成分之上端部露出的方式調節移植深度，復就可提高與接受者的上皮系細胞之連續性這點而言較佳。
    又，將具有導引件的再生毛囊原基移植後，可以使導引件不拔除的方式用皮膚接合用膠帶、帶子(band)等固定導引件與對象部位。
    導引件在移植再生毛囊原基後暫時確保接受者側的上皮系細胞與源自再生毛囊原基的上皮系細胞之側的連續性後，可從移植部位拔除。拔除導引件的時間點可適宜地設定，例如較佳係移植後3天至7天時從移植部位拔除。或者可放置到導引件自然從移植部位脫落為止。生物體吸收性的材料的導引件可放置到自然從移植部位脫落、分解/吸收為止。
    如此方式，對移植用再生毛囊原基保持導引件，藉此接受者側的上皮系細胞為了排除異物而沿著導引件往移植部位的內側延伸，另一方面，源自再生毛囊原基的上皮系細胞之細胞沿著導引件延伸。藉此，可提昇移植後的接受者側的上皮系細胞與再生毛囊原基的上皮系細胞側之連續性。又，藉由導引件的插入，培養中的再生毛囊原基中，可提昇上皮系細胞及間葉系細胞之極性的維持而較佳。藉此，提高毛囊形成的效率的同時，並可容易決定移植時方向。尤其是對再生毛囊原基使用導引件時，可確保再生毛囊原基與接受者側的上皮系細胞之連續性，並且可促使毛囊往意圖的方向形成。結果，可提昇從再生毛囊原基的生毛率同時，並可控制生毛方向。
    再者，本說明書中使用的用語係說明特定實施態樣用，無限定發明之意圖。
    又，本說明書中使用的「含有」之用語，除了從上下文明顯應該解釋為不同意義時以外，係存在有記述的事項(構件、步驟、要素、數字等)之意圖者，不排除除此以外的事項(構件、步驟、要素、數字等)的存在。
    若無不同定義時，在此使用的所有用語(包含技術用語及科學用語)係與本發明所屬技術領域者所廣泛理解的用語有相同意義。在此使用的用語在無標明不同定義時，應解釋為與本說明書及相關技術領域之意義有整合的意義者，不應解釋為理想化或過度形式上的意義。
    本發明之實施態樣係有一邊參考示意圖一邊說明之情況，當為示意圖時，為了明確說明，有誇張表現之情況。
    第一、第二等用語係用以表現各種要素，理解該等要素不限於該等用語。該等用語僅用以區分一要素與其他要素，例如將第一要素標示為第二要素，同樣地將第二要素標示為第一要素並不超出本發明之範圍。
    又，本說明書中，毛囊之上方或下方的表現係方便上，於毛囊的構成中，毛乳突存在的部分作為下方，毛囊中毛乳突之相反側，亦即毛之生毛/延伸方向作為上方。
    下述係參考實施例以更詳細說明本發明。然而，本發明可由多種態樣而具體化，不應解釋為限定於在此所記載之實施例。 (實施例) 1.材料與方法 (1)實驗動物
    從7至8週大的C57BL/6小鼠(日本CLEA)及C57BL/6 6-TgN(act-EGFP)小鼠採取毛囊。又，將藉由下述實驗手法而製作之再生毛囊原基移植至6至8週大的Balb/c nu/nu小鼠(SLC)。動物的飼育及實驗係遵守相關法規、省令、及準則，並在東京理科大學動物實驗倫理審查會的認可下實施。 (2)毛乳突細胞的培養
    藉由頸椎脫臼使7至8週大的C57BL/6小鼠安樂死後，以不傷害毛球部的方式採取頰部皮膚全層及皮下組織。去除臉頰鬍鬚周圍的皮下組織後，分離毛囊。從分離的毛囊中選擇出成長期I-IV期的臉頰鬍鬚毛囊，從選擇的臉頰鬍鬚毛囊使用25G注射針清除膠原蛋白鞘，使毛囊露出。並且，從露出的毛囊分離毛球部，摘出毛乳突。再來，分離的毛囊及摘出的毛乳突使用含有10mM的HEPES、10%胎牛血清、及1%青黴素-鏈黴素溶液之DMEM培養基(DMEM10)作為作業中用以保存之保存液。分離的毛乳突種植於3.5cm培養塑膠皿(日本Becton-Dickinson)，於含有10ng/ml的FGF2(和光純藥)之DMEM10，在5% CO2、37℃、濕度95%環境下進行初代培養。初代培養毛乳突細胞在第4天及第8天交換培養基，培養9天後，使用於製作再生毛囊原基。培養9天後的初代培養毛乳突細胞以PBS(-)洗淨3次後，用含有0.05%胰蛋白酶的10mM EDTA溶液(GIBCO)剝離，以DMEM10中和胰蛋白酶，充分洗淨後於冰溫下保存到使用時為止。 (3)毛囊隆起上皮細胞的取得
    從上述(2)中分離的臉頰鬍鬚組織的毛囊，使用25G注射針而清除膠原蛋白鞘，分離隆起區域。隆起區域組織於最終濃度4.8U/ml的Dispase II(Becton Dickson)及100U/ml的Collagenase(Worthington，Lakewood，NJ)溶液中，於37℃反應4分鐘，其後，使用25G注射針外科上將隆起區域上皮組織與隆起周圍的間葉組織分離。分離的隆起區域上皮組織於0.05% Trypsin(Invitrogen，Carlsbad，US)用培養箱進行酵素處理1小時，通過35μm孔徑細胞濾器(cell strainer)而成單一化細胞。
    又，製作再生毛囊原基之前，將培養毛乳突細胞以0.05% Trypsin(Invitrogen，Carlsbad，US)回收，通過35μm孔徑細胞濾器而成單一化細胞。 (4)再生毛囊原基的製作
    再生毛囊原基係依照器官原基法而製作。以下記載詳細順序。如上述方式取得之單一化的隆起區域細胞與單一化的培養毛乳突細胞，分別移到塗布有矽氧樹脂滑脂(silicone grease)的1.5ml離心小管(microtubes)(Eppendorf)，放進離心分離器。為了回收藉由離心分離沉澱之單一化的隆起區域細胞或單一化的培養毛乳突細胞，將離心後的培養液的上清使用GELoader Tip0.5-20ml(Eppendorf)而完全除去。接著，在塗佈有矽氧樹脂滑脂(Dow Corning Toray)的培養皿(petri dish)上，將Cellmatrix type I-A(Nitta gelatin，Osaka，Japan)30ml滴入以製作膠原蛋白凝膠滴，將上述調製之單一化的培養毛乳突細胞使用0.1至10ml的滴管尖端(pipette tip)(Quality Scientific plastics)，注入0.2ml左右以製作細胞凝集塊。接著，於相同凝膠滴內，將上述調製的隆起區域細胞使用0.1至10ml的滴管尖端(Quality Scientific plastics)，以使其密接於培養毛乳突細胞的凝集塊上的方式注入0.2ml左右以製作細胞凝集塊。並且，將比起細胞凝集塊的隆起區域細胞更長之全長5mm的尼龍線(松田醫科工業)插上，其後於37℃靜置5分鐘，使凝膠滴固化，藉此使隆起區域細胞與培養毛乳突細胞之結合更堅固以製作再生毛囊原基。
    如下述(5)及(6)所述，調整副隆起區域細胞及毛基質底細胞，使用於製作再生毛囊原基。 (5)副隆起區域細胞的調製
    與(3)所述之隆起區域的取得相同順序，從7至8週大的C57BL/6小鼠的臉頰鬍鬚的毛囊中分離出比Ringwurst附著部位更上方的恆定區域，將鄰接隆起區域的恆定部最下端部作為副隆起區域並分離，酵素處理及使用細胞分離用過濾器，作為單一化的副隆起區域細胞。 (6)毛基質底部細胞的調製
    從上述(2)中分離之7至8週大的C57BL/6小鼠臉頰鬍鬚組織的毛囊的毛球部去除膠原蛋白鞘與真皮毛根鞘，使用25G注射針將鄰接於毛乳突的基底部之毛基質底部組織分離。分離的毛基質底部組織以0.25%胰蛋白酶於37℃處理10分鐘，以DMEM10洗淨後，通過35μm孔徑細胞濾器，作為單一化的毛基質底部細胞。
    (4)所述之再生毛囊原基的製作法中，將單一化的隆起區域細胞由離心分離而濃縮時，上述(6)或(7)所得之單一化的約400個副隆起區域細胞或單一化的約400個毛基質底部細胞與約10,000個隆起區域上皮細胞混合，藉由離心分離，製作含有單一化的副隆起區域細胞或單一化的毛基質底部細胞與單一化的隆起區域細胞之細胞凝集塊。將如此方式而得到之細胞凝集塊取代隆起區域細胞，以使其密接於凝膠滴內的培養毛乳突細胞的凝集塊上的方式注入，作為副隆起區域細胞添加群或毛基質底部細胞添加群製作再生毛囊原基。
    藉由如上述之方法，將凝膠中製作的各再生毛囊原基連同膠原蛋白凝膠移動至設置於添加有1ml的DMEM10之6孔盤(Becton-Dickinson)的0.4ml孔徑大小之細胞培養插件(Cell Culture Insert，Becton-Dickinson)上，於37℃、5% CO2、濕度95%條件下進行培養2天。 (8)再生毛囊原基的裸鼠皮內移植
    對裸鼠依照既定方法進行戊巴比妥(pentobarbital)麻醉，背部進行普維酮碘(isodine)消毒後，使其為自然橫臥位。使用V-Lance微解剖刀(日本Alcon)進行穿刺，從皮膚表皮層直到真皮層下層部為止形成移植創傷。從移植創傷係體表面之垂直方向的深度達400μm，水平方向作為1mm左右。從插入尼龍線製導引件的再生毛囊原基去除膠原蛋白凝膠，以上皮細胞成分朝向移植創傷的體表側的方式插入。於移植創傷上端部，以使再生毛囊原基的上皮細胞成分之上端部露出的方式調節移植深度，以使尼龍線製導引件露出體表面的方式設置。將尼龍線製導引件使用Steri-Strip(3M)固定於接近移植創傷的皮膚表面，其後，使用Nurseban及Surgical tape(3M)保護移植創傷。移植後5至7天去除保護膠帶，以目視或螢光立體顯微鏡判定移植物的接枝後進行經過觀察。 (9)生毛經過觀察及組織學的分析
    以目視及螢光立體顯微鏡觀察再生毛囊原基的移植部位，評估生毛。 2.結果 (1)由再生毛囊原基的皮內移植而再生體毛與鬍鬚之毛色
    藉由以有色小鼠的源自成體臉頰鬍鬚的隆起區域與源自成體臉頰鬍鬚的毛乳突細胞所製作之再生毛囊原基的移植而再生的鬍鬚有95.5%的頻率為白色(第2圖a)。如第1圖所示，已知黑色素沉澱於毛幹而控制毛色之色素幹細胞係分布於隆起區域下方的副隆起區域。又，黑色素細胞的前驅細胞亦分布於毛球部的毛基質底部，於毛基質中分化成黑色素細胞而毛幹附著顏色。源自成體臉頰鬍鬚的再生毛囊原基係局限於不含黑色素原細胞的隆起區域而構築再生毛囊原基，因此再生毛囊原基不具有黑色素原細胞，因不含有分化成再生的毛囊的毛基質之黑色素細胞，暗示有變成白色之可能性。 (2)由添加色素幹細胞控制毛色
    小鼠成體臉頰鬍鬚毛囊中，取得從存在著有色毛黑色素原細胞的副隆起區域以及分布黑色素細胞前驅細胞的毛基質底部區域分別單一化的細胞，添加於構成再生毛囊原基的細胞集合體時，檢驗是否對再生毛的毛色造成影響。將再生毛囊原基進行皮內移植後3週後，解析生毛的毛幹的顏色與性狀之結果，副隆起區域或毛基質底部添加細胞之兩個區中，成功得到黑色毛的再生毛(第2圖b的黑色箭頭及第2圖c)。
    在此，從再生毛囊原基再生的毛囊，形成黑色毛的毛囊中，為了確認是否與天然毛囊同樣形成有黑色素原細胞的幹細胞棲位，而進行黑色素原細胞的分化譜系標記之多巴色素異構酶(dopachrome tautomerase：Dct)的原位雜交時。結果，對於源自有色小鼠成體臉頰鬍鬚的隆起區域以及毛乳突細胞的細胞集合體，添加副隆起區域的單一化細胞而製作的源自再生毛囊原基的毛囊，形成黑色毛的毛囊中，與天然毛囊同樣地，可在應該存在黑色素原細胞的幹細胞棲位的位置之副隆起區域的外毛根鞘檢測出黑色素原細胞。此係顯示藉由以添加副隆起區域的單一化細胞所製作之再生毛囊原基而再生的毛囊，形成黑色素原細胞的幹細胞棲位且適宜地容納黑色素原細胞。另一方面，藉由以源自有色小鼠成體臉頰鬍鬚的隆起區域與毛乳突細胞所製作之再生毛囊原基而再生的毛囊，形成白色毛的毛囊中，在應該存在黑色素原細胞的幹細胞棲位的位置無法檢測出黑色素原細胞(第3圖)。
    又，測量有無添加副隆起區域細胞或毛基質底細胞所致之毛色變化的頻率。結果，副隆起區域細胞添加群中，65.4%成為有色，與單獨使用隆起區域細胞作為上皮系細胞之對照組進行比較，黑色毛的比率變高為14.5倍(第4圖)。同樣地，毛基質底區域細胞添加群中，31.6%成為黑色毛，與單獨使用隆起區域細胞之對照組進行比較，黑色毛率變高為7.0倍(第4圖)。又，採取藉由以添加毛基質底細胞所製作之再生毛囊原基而生毛的毛，以掃描型電子顯微鏡解析毛幹的表面形態時，觀察到其與天然毛同樣地，角質層結構發達(第5圖)。
    在此，作出黑色毛之再生的毛囊中，黑色素原細胞的幹細胞棲位重現幹細胞維持功能，為了確認是否可永續地形成黑色毛，觀察藉由移植而經過長期間後的再生的毛囊中之黑色毛形成能力。使用對於源自有色小鼠成體臉頰鬍鬚的隆起區域上皮細胞與源自成體小鼠臉頰鬍鬚的毛乳突細胞，添加源自毛基質底部區域的單一化細胞所製作之再生毛囊原基(添加毛基質底部區)作為觀察所用的再生毛囊原基。再者，作為對照區，觀察藉由以源自有色小鼠成體臉頰鬍鬚的隆起區域上皮細胞與源自成體小鼠臉頰鬍鬚的毛乳突細胞所製作之再生毛囊原基的移植而再生的毛囊。
    結果，添加毛基質底部區中，再生毛囊原基移植後第36天及第306天中，亦確認到黑色毛形成(第6圖)。本試驗中，藉由再生毛囊原基形成的毛囊平均以約15日為毛周期之1周，確認平均約20次重複形成黑色毛。另一方面，對照區中，即使在移植後第306天中，只確認到白色毛的形成。
    依據該等結果，顯示添加含有黑色素原細胞或黑色素細胞前驅細胞之區域的細胞於再生毛囊原基中，藉此可控制毛色。又，顯示藉由以色素幹細胞的添加所製作之再生毛囊原基而生長的有色毛具有正常形態的毛幹。
    再者，顯示藉由以色素幹細胞的添加所製作之再生毛囊原基而再生的毛囊，該毛囊內可再生黑色素原細胞的幹細胞棲位。又，顯示藉由以色素幹細胞的添加所製作之再生毛囊原基而再生的毛囊可永續地維持有色毛的形成。此顯示再生的毛囊內的黑色素原細胞的幹細胞棲位中，經過長期間可維持黑色素原細胞且更可重現毛囊的生理功能，供給黑色素細胞於毛基質。
    第1圖係表示毛囊中之黑色素原細胞與黑色素細胞前驅細胞的分布之示意圖。於毛囊的副隆起區域存在分布有黑色素原細胞之黑色素原細胞棲位，於毛基質底部分布有黑色素細胞前驅細胞。第1圖中，DP表示毛乳突，SG表示皮脂腺。
    第2圖係表示將藉由下述三個條件製作之再生毛囊原基移植後，毛囊再生，生毛的移植部位之立體顯微鏡的照片(第2圖a至c)。第2圖a表示移植有從源自成體小鼠臉頰鬍鬚的隆起區域上皮細胞與源自成體小鼠臉頰鬍鬚的毛乳突細胞所製作之再生毛囊原基的生毛部位(對照組)。又，對於源自成體小鼠臉頰鬍鬚之隆起區域上皮細胞與源自成體小鼠臉頰鬍鬚之毛乳突細胞，更添加源自成體小鼠臉頰鬍鬚之副隆起區域細胞而製作再生毛囊原基，移植時的生毛部位表示於第2圖b(添加副隆起區)，更添加源自成體小鼠臉頰鬍鬚之採取自毛基質底部的細胞而製作再生毛囊原基，移植時的生毛部位表示於第2圖c(添加毛基質底部區)。對照組係相對於得到白色毛(第2圖a)，添加副隆起區及添加毛基質底部區可得黑色毛(第2圖b的黑色箭頭及第2圖c)。再者，第2圖b的白色箭頭表示白色的再生毛。
    第3圖表示天然毛囊或藉由移植再生毛囊原基而再生的毛囊的黑色素原細胞幹細胞棲位存在部位之副隆起區域的外毛根鞘中，進行黑色素原細胞的分化譜系標記之多巴色素異構酶(dopachrome tautomerase：Dct)的原位雜交(in situ hybridization)時的結果。第3圖的影像表示原位雜交後於螢光顯微鏡下拍攝的影像。第3圖A至C分別為：(A)具有黑色毛之天然毛囊；(B)源自再生毛囊原基之具有白色毛的毛囊，該再生毛囊原基係由源自成體小鼠臉頰鬍鬚之隆起區域上皮細胞與源自成體小鼠臉頰鬍鬚之毛乳突細胞所製作；(C)源自再生毛囊原基之具有黑色毛的毛囊，該再生毛囊原基係對於源自成體小鼠臉頰鬍鬚之隆起區域上皮細胞與源自成體小鼠臉頰鬍鬚之毛乳突細胞，更添加源自成體小鼠臉頰鬍鬚之副隆起區域細胞(添加副隆起區)而製作之影像。第3圖中的箭頭表示多巴色素異構酶的檢出部位。
    第4圖表示從源自成體小鼠臉頰鬍鬚之隆起區域上皮細胞與源自成體小鼠臉頰鬍鬚之毛乳突細胞所製作的再生毛囊原基(對照組)，將對於源自成體小鼠臉頰鬍鬚之隆起區域上皮細胞與源自成體小鼠臉頰鬍鬚之毛乳突細胞，更添加源自成體小鼠臉頰鬍鬚之副隆起區域細胞(添加副隆起區)或採取自源自成體小鼠臉頰鬍鬚之毛基質底部的細胞(添加毛基質底部區)而製作的再生毛囊原基移植後，最初生毛之毛的有色毛率。
    第5圖表示使用源自成體小鼠臉頰鬍鬚之隆起區域上皮細胞、源自成體小鼠臉頰鬍鬚之毛乳突細胞以及採取自源自成體小鼠臉頰鬍鬚之毛基質底部的細胞而製作之再生毛囊原基移植至接受者小鼠的皮內，用電子顯微鏡觀察從再生的毛囊生毛之毛的毛幹之結果。
    第6圖表示藉由下述二個條件製作之再生毛囊原基的移植後第36天及移植後第306天中，其生毛的移植部位於立體顯微鏡拍攝的照片。第6圖中，左圖及中圖表示對於源自成體小鼠臉頰鬍鬚之隆起區域上皮細胞與源自成體小鼠臉頰鬍鬚之毛乳突細胞，更添加採取自源自成體小鼠臉頰鬍鬚之毛基質底部的細胞而製作再生毛囊原基，移植後第36天以及第306天的生毛部位(添加毛基質底部區)。又，第6圖中，右圖表示從源自成體小鼠臉頰鬍鬚之隆起區域上皮細胞與源自成體小鼠臉頰鬍鬚之毛乳突細胞所製作的再生毛囊原基移植後，第306天的生毛部位(對照組)。
    本案不指定代表圖，本案圖式為示意圖或實驗結果。
    权利要求:
    Claims (15)
    [1] 一種移植後生長的生毛毛色經控制之移植用再生毛囊原基的製造方法，包括下述步驟：調製含有間葉系細胞的第1細胞集合體之步驟；調製含有上皮系細胞的第2細胞集合體之步驟；調製含有色素幹細胞的細胞集合體之步驟；使前述第1細胞集合體與前述第2細胞集合體至少其中一者與前述含有色素幹細胞的細胞集合體結合之步驟；以及接下來，使前述第1細胞集合體和前述第2細胞集合體至少其中一者與前述含有色素幹細胞的細胞集合體結合之前述第1細胞集合體與前述第2細胞集合體密接，並於支撐體內部培養之步驟。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中，前述第1細胞集合體係實質上由間葉系細胞構成。
    [3] 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中，前述第2細胞集合體係實質上由上皮系細胞構成。
    [4] 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之製造方法，其中，前述含有色素幹細胞的細胞集合體係經過單一化處理者。
    [5] 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之製造方法，其中，前述色素幹細胞係源自副隆起區域(sub-bulge region)的黑色素原細胞(melanoblast)或源自毛基質底部的黑色素細胞前驅細胞。
    [6] 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之製造方法，其中，前述色素幹細胞係源自毛基質底部的黑色素細胞前驅細胞。
    [7] 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述之製造方法，其中，在使前述細胞集合體彼此結合之步驟中，前述第1細胞集合體的細胞數或前述第2細胞集合體的細胞數，與前述含有色素幹細胞的細胞集合體的細胞數之比在0.1：1至100：1的範圍內。
    [8] 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述之製造方法，其中，在使前述第1細胞集合體與前述第2細胞集合體密接，並於支撐體內部培養之步驟中，前述第1細胞集合體的細胞數與前述第2細胞集合體的細胞數之比在0.3：1至1：1的範圍內。
    [9] 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述之製造方法，其中，前述間葉系細胞係毛乳突(hair papilla)細胞或真皮毛根鞘細胞。
    [10] 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述之製造方法，其中，前述上皮系細胞係隆起區域上皮細胞或毛基質底部上皮細胞。
    [11] 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述之製造方法，其中，前述間葉系細胞或上皮系細胞係源自成體的毛囊。
    [12] 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項所述之製造方法，復包含於前述再生毛囊原基中插入導引件(guide)之步驟。
    [13] 一種含有毛色經控制之移植用再生毛囊原基之組成物，係藉由申請專利範圍第1項至第12項中任一項所述之製造方法而製作。
    [14] 一種毛色經控制之移植用再生毛囊原基之移植方法，係包含將藉由申請專利範圍第1項至第12項中任一項所述之製造方法而製作之移植用再生毛囊原基移植到對象部位之步驟。
    [15] 一種毛色經控制之移植用再生毛囊原基之移植方法，該方法包含將藉由申請專利範圍第12項所述之製造方法而製作之移植用再生毛囊原基移植到對象部位之步驟，藉由使前述導引件維持在比移植部位更突出的狀態，而使移植的再生毛囊原基的上皮系細胞側的一部分與前述對象之上皮系細胞沿著導引件延伸、連結。
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    法律状态:
    优先权:
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